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重组蝎毒素基因表达的研究进展
作者:佚名    科研信息来源:本站原创    点击数:    更新时间:2003-1-29

[关键词]:蝎毒素;基因;表达

健康网讯:

    摘要:目的介绍重组蝎毒素基因表达的研究进展。方法 根据近年来国内外公开发表的有关研究 论文,综述重组蝎毒素基因表达的研究。结果与结论 通过筛选得到的蝎毒素基因或化学合成的编 码蝎毒素的基因分别在大肠杆菌、酵母细胞、哺乳动物细胞、昆虫中都有过表达尝试。重组 蝎毒素基因表达的关键是如何使有活性的重组蛋白高水平表达。

    蝎毒素是研究蛋白质结构和功能关系很好的 模型,而且是神经药理学和免疫学研究的理想工 具。同时作为未来新型的药物和杀虫剂,蝎毒素 也正在展示出十分诱人的潜力和前景,因此在国 内外得到广泛研究。但是,由于天然纯蝎毒素蛋 白获得比较困难,因而其结构和功能的研究及其 应用都受到很大的限制。重组蝎毒素基因的表 达,可以比较容易获得高纯度的蝎毒素蛋白以便 进行研究和应用。作者综述了重组蝎毒素基因表 达这一研究领域的主要进展。

    重组蝎毒素基因在原核细胞中的 表达

    重组蝎毒素基因在大肠杆菌中的表达体系

    非融合型表达

    尽管从1989年Bougis开始,许多科研工作 者尝试用大肠杆菌表达蝎毒素,但是都没有成功。 直到Zilberberg以pET11cK为表达载体在大肠 杆菌中表达了昆虫特异性蝎神经毒素LqhαIT,这 是第一个在大肠杆菌中表达的重组钠通道神经毒 素。随后昆虫特异性蝎神经毒素Lqh IT2和具有 抗神经兴奋活性的多肽ANEP也先后在大肠杆 菌中得到表达,但是他们所得到的重组蛋白 都是没有活性的包涵体,需要经过溶解和重新折 叠才能获得有活性的重组蛋白。

    融合型表达

    通过把真核基因与大肠杆菌基因融合而形成 的融合蛋白可以提高表达水平并防止其降解。融 合蛋白也可以直接免疫动物,获得抗体应用于临 床。目前已经用于重组蝎毒素基因融合表达 的原核基因主要有噬菌体T7基因9、β-半乳糖苷 酶、麦芽糖结合蛋白和2个来源于 Staphyococcus anreus的蛋白A上抗原结合区段 (Z domin)。其中噬菌体T7基因9的蛋白作为 融合表达的载体具有两个明显的优点,一是融合 蛋白的稳定性高,二是在融合载体编码的序列中 没有半胱氨酸存在。通过与该基因融合,化学合 成的短肽链神经毒素Charybdotoxin(CTX)、 Margatoxin(MgTX)、Noxiustoxin(NTX)获 得了结构和功能与天然毒素完全一致的重组蛋 白。但是融合蛋白必须经过特异性裂解后才能获 得完整的目标产物。目前最为常用的裂解方法有 化学法和酶法。化学法特异性差,而且裂解条件 剧烈;酶法特异性较强,但是裂解效率不高。

    提高蝎毒素基因在大肠杆菌中表达水平的 措施

    目前重组蝎毒素基因表达的关键仍然是如何 获得大量有活性的重组蛋白。可以通过下述几个 方面来调整实验,从而提高活性重组蛋白的表达 水平。

    提高翻译水平

    确认转录终止子的存在。因为转录终止子的 存在可以增强mRNA的稳定性,并减少核苷酸在 细胞中的消耗;通过改变核糖体结合位点、启动子 强度或诱导物的量而改变合成的动力学;核糖体 结合住点周围的二级结构可能会降低翻译起始效 率,为此,去除核糖体结合位点周围潜在的二级结 构可以促进翻译的起始;在目标DNA的下游设 计一段可以稳定mRNA或能提高翻译效率的 DNA序列,提高表达水平;利用RNA代谢改变的 突变株来提高功能性RNA的含量。

    避免稀有密码子。稀有密码子可能是表达水 平低的原因,当这些稀有密码子出现在氨基酸序 列N末端或者连续出现时,则可能导致核糖体停 滞而引起翻译与转录的解藕联,导致转录的提前 终止。然而,值得注意的是,在高效表达的大肠杆 菌中,只有一小部分密码子的tRNA的浓度很低 而影响表达,一般而言,稀有密码子不会成为限速 步骤。

    减轻细胞的代谢负荷,提高外源基因的表 达水平

    外源基因在细菌中的表达,必然影响宿主菌 的生长和代谢,而细胞代谢的损伤,又必然影响外 源基因的表达。因此,合理的调节好宿主细胞的 代谢负荷与外源基因高效表达的关系,是提高外 源基因表达水平不可缺少的一个环节。目前常用 的方法有诱导表达、表达载体的诱导复制和表达 分泌蛋白三种方法:a、诱导表达,是将宿主菌的 生长和外源基因的表达分成两个阶段,是减轻细 胞代谢负荷最常用的一种方法。b、减轻宿主细 胞代谢负荷的另一个措施是将宿主菌的生长和表 达质粒的复制分开。当宿主菌迅速生长时,抑制 质粒的复制;当宿主菌生物量积累到一定水平后, 再诱导细胞中质粒的复制,增加质粒的拷贝数,从 而提高外源基因表达水平。c、表达分泌型蛋白 不仅可以减轻宿主细胞代谢负荷,也是防止宿主 菌对表达产物的降解的最有力措施。

    提高表达蛋白的稳定性,防止降解

    通过表达融合蛋白、分泌蛋白、在培养及收获 菌体期间使用蛋白酶抑制剂和采用某种突变菌株 如lon,hfl.和htpR等方法,保护表达蛋白不被 降解。蛋白质N末端残基和蛋白质在大肠杆菌 中稳定性有关。当Arg、Lys、Phe、Leu、Trp、Tyr 在N末端时,蛋白质的半衰期只有2min,相比之 下当其他氨基酸在N末端的蛋白质半衰期长于 10h,这就是所谓N末端规则。而且,蛋白质N 末端fMet的切除是受甲硫氨酸氨肽酶的催化,紧 接甲硫氨酸的下一个氨基酸残基的侧链越长,甲 硫氨酸氢肽酶的切割效率越低,蛋白质被降解的 可能性就越大。有时见到表达产物的碎片未必是 由于重组蛋白降解产生的。当重组蛋白中甲硫氨 酸密码子上游513个核酸处有一端类似于核糖体 结合位点的序列时,就会产生第2个翻译起始位 点,从而出现表达产物的碎片。庆幸的是大多数 蝎毒素基因中并没有甲硫氨酸存在。

    在许多情况下,蛋白质不稳定的问题可以通 过提高外源蛋白的合成量加以克服。

    尽量减少包涵体的形成

    在原核细胞中表达外源基因,尤其是以大肠 杆菌为宿主菌高效表达外源基因时,表达蛋白常 常在细胞质中聚集,形成包涵体。包涵体的形成, 一方面有利于防止蛋白酶对表达蛋白的降解,易 于分离表达产物;另一方面包涵体形成后,表达蛋 白不具有生物活性,因此必须溶解包涵体并对表 达蛋白进行复性后才能获得有活性的重组蛋白。 包涵体的形成过程和原因还不十分清楚。尤其是 对于蝎毒素基因,大多含有3或4对二硫键,二硫 键的错配也可能导致包涵体的形成。可以通过改 变表达条件、融合表达、共表达分子伴侣和折叠酶 及使用thioredOxin还原酶缺失(trax B-)菌株等 方法来增加可溶性表达组分的含量。值得注 意的是不溶的重组蛋白未必就是包涵体,而可溶 性重组蛋白也可能是二硫键错配导致的没有活性 的形式。

    重组蝎毒素基因在真核细胞中的 表达

    重组蝎毒素基因在酵母细胞中的表达

    酵母作为单细胞真核生物,易于培养,生长繁 殖速度快,具有比大肠杆菌更加完备的基因表达 调控机制、基因表达产物正确折叠的细胞内环境 以及对产物的加工修饰及分泌能力。尤其是酿酒 酵母,它的基因测序已经于1996年完成,而且安 全性高,因此酵母作为基因工程表达系统得到广 泛的研究和应用。Shao F等在酿酒酵母中成 功表达了来源于东亚钳蝎的哺乳动物神经毒素 BmK M1,并且分泌到培养基中,表达水平达到 5mg/L发酵液。虽然跟天然BmK M1相比,重组 BmK M1在N端有两个额外的氨基酸残基,但是 并没有影响活性。相比之下,当没有额外的氨基 酸存在时,表达板不稳定。这种酵母表达蝎毒素 基因工程产物时信号肽切除不完全的现象在 Pang等将化学合成的抗昆虫毒素短肽BeI5A 的基因转入酵母菌中时就曾经有过。实验证明, 当细胞内有大量外源蛋白质合成时,酵母氨肽酶 的活力不足以切除他们氨基末端多余的氨基酸残 基,酵母的自身平衡调节机制被破坏,就会出现信 号肽切除不完全现象。

    除了上述基因外,在酿酒酵母中表达的重组 蝎毒素基因还有昆虫特异性蝎神经毒素AaH IT1。但是只有很小的一部分重组蛋白被释放 到培养基中。这也是由于酿酒酵母的分泌效率不 太高而造成的。而且酿酒酵母缺乏强有力的启动 干,不适应高密度培养。基于以上问题,人们开发 了甲醇营养型酵母和裂殖酵母作为第二代酵母外 源基因表达系统,但是目前还没有这两类酵母表 达重组蝎毒素基因的实践。

    重组蝎毒素基因在昆虫细胞培养物中的表达

    一种颇受欢迎的超量表达重组蛋白质的真核 细胞表达系统是利用杆状病毒发展起来的。目前 应用最广泛的杆状病毒表达系统利用了一种称为 苜蓿银纹夜蛾多核形多角体病毒(Autographa califormica nucleopolyhedro-virus,AcNPV)的溶 原性病毒。杆状病毒表达系统作为表达系统,可 以利用存在于高等真核细胞中的多种蛋白质的修 饰、加工和转运体系,超量表达可溶性重组蛋白。 另外,杆状病毒基因组较大(130kb),可以容纳较 大的外源DNA片断,而且对脊椎动物没有感染 性。目前已经部分用杆状病毒表达的蝎毒蛋白有 Aa IT、AaH IT、LqhαIT、Belt、 LqhIT1和Lqh IT2等。此外,Higgs等 将编码AaH IT的基因重组在不能杀死蚊子的 dsSIN(double subgenomic Sindbis)病毒上,然后 注入蚊子体内而引起蚊子的死亡。

    重组蝎毒素基因在哺乳动物细胞培养物中 的表达

    重组蝎毒素基因在COS细胞中的短暂表达

    COS细胞来源于复制子缺失的猴病毒40 (SV40)转化的非洲绿猴肾细胞,它最常用于短暂 表达。短暂表达可以阐明一个克隆具有某种功能 活性或鉴定此活性;也已用于筛选cDNA文库,分 离编码细胞表面蛋白、分泌蛋白和与DNA结合 的蛋白的cDNA;并可在制备稳定的细胞株之前 对蛋白表达载体进行快速实验。Bougis等将编 码toxin Ⅱ的cDNA连接在质粒载体上转入 COS-7细胞,瞬时表达了具有免疫学和生物学 活性的重组toxinⅡ,体外检测、免疫学检测和受 体检测都表明重组蛋白与天然蛋白无异。

    重组蝎毒素基因在鼠成纤细胞中的表达

    Dee A等在一种鼠源逆转录病毒长末端 重复性的转录控制下,在鼠成纤细胞NIH/3T3 中表达了编码昆虫特异性蝎神经毒素AaIT的合 成基因。AaIT毒素蛋白在人白细胞介素-2信号 肽的引导下分泌到培养基中。所产生的AaIT毒 素蛋白对黄热蚊的幼虫具有毒性,而对鼠无毒。

    用ELISA筛选表达库

    Kalapothakis等从Tityus serrulatus和 Tityus bahiensis粗毒中提取mRNA,构建cDNA 表达库,用ELISA从cDNA表达库中筛选具有免 疫原性的蛋白。这种方法可以产生利于基因组学 和蛋白质组学研究的免疫原库。

    展望

    当今对蝎及蝎毒的研究已经远远超过起初蝎 公害防治的范围。人们也一直致力于蝎毒素的表 达,但是表达仍然是一门不精确的科学,经验性 强,可预测性差。相信随着蛋白质组学的研究深 入,人们对生命活动的本质和活动规律有了更进 一步的了解之后,对于重组蝎毒素基因及至其他 基因的表达都会有深入的理解。

    (刘岩峰,张景海 沈阳药科大学制药工程学院)

    (沈阳药科大学学报) }